جلد 5 شماره 1391 4 تا ثير متابوليت هاي Lactobacillus rhamnosus GG بر روي رده سلول سرطاني CacoII لادن 3 1 * پارساسرشت محمدرضا فاضلي نسرين صمدي حسين جمالي فر اكرم عيدي و حميده محمودي اصل 1 زاده 1 تهران دانشگاه آزاد اسلامي واحد علوم و تحقيقات دانشكده علوم پايه گروه ميكروبيولوژي تهران دانشگاه علوم پزشكي تهران دانشكده داروسازي گروه كنترل دارو و غذا 3 تهران دانشگاه آزاد اسلامي واحد علوم و تحقيقات دانشكده علوم پايه گروه زيست شناسي تاريخ دريافت: 88/1/17 تاريخ پذيرش: 89/11/10 چكيده هدف از اين مطالعه بررسي اثر مهاري متابوليت هاي Lactobacillus rhamnosus GG (باكتري پروبيوتيك) بر روي رشد رده سلولهاي سرطاني CacoII بود. پس از بررسي صحت جنس و گونه باكتري از آن كشت آبگوشتي در محيط MRS تهيه و از هركدام از كشتهاي 48 4 و 7 ساعت دو سوپرناتانت آماده شد يكي داراي ph نرمال( (ph=4 بود و ديگري با استفاده از NaoH 1N به ph خنثي( ph= 7 ( رسانده شد.سلولهايCacoII در ميكروپليت 96 خانه اي به مقدار 10 3 8 سلول در هر چاهك كشت داده شد و سوپرناتانت هاي به دست آمده در غلظتهاي 00 100 و 300 ميكروليتر/ميلي ليتر بر روي سلولهاي CacoII تلقيح شدند. بر اساس اين مطالعه به طور ميانگين متابوليت هاي Lactobacillus rhamnosus GG در غلظتهاي 100 00 و 300 ميكروليتر/ميلي ليتر بترتيب 60/8 7/5 و 8/1 درصد رشد سلولهاي سرطاني CacoII را مهار كردند. CacoII پروبيوتيك واژه هاي كليدي: Lactobacillus rhamnosus GG مقدمه * نويسنده مسي ول تلفن : 88405406 پست الكترونيكي: pinksky_ll0@yahoo.com مطالعات اپيدميولوژي نشان ميدهد كه سرطان كولون شيوع زيادي در كشورهاي توسعه يافته دارد و در قرنهاي اخير به طور افزاينده اي افزايش پيدا كرده است (6).الگوهاي رژيمي مانند چربي زياد و فيبر كم از عوامل مهم ايجاد سرطان كولون هستند (4). مجموعه متنوعي از ميكروفلور در روده انسان نقش مهمي را در برابر بيماريها و سلامت انسان بازي ميكنند. تواناييهاي متابوليكي اين ميكروفلور سبب توليد آنزيمهاي باكتريايي مانند β گلوكورونيداز نيتروردوكتاز آزوردوكتاز 7-α دهيدروكسيلاز و كلسترول دهيدروژناز ميشود كه در شكل گيري پروسه كارسينوژنيك با آزاد كردن كارسينوژنها در روده نقش دارند (5 و 1). Escherichia coli يكي از ساكنان نرمال در روده انسان است كه با به دست آوردن فاكتور هاي ويرولانس مانند فاكتور نكروز دهنده سميI بسيار بيماري زاست و در ايجاد سرطان كولون با توليد توكسين خطرناك و فاكتور نكروز دهنده سميI نقش مهمي بازي مي كند (15). در نقطه مقابل پروبيوتيكها ميكروارگانيسمهاي زنده در مكملهاي غذايي هستند كه اگر به مقدار كافي مصرف شوند براي سلامت انسان مفيد مي باشند (14). باكتريهاي پروبيوتيك كه به عنوان غذاهاي عملكردي نام برده ميشوند از گروه باكتريهاي اسيد لاكتيك هستند( LAB ). مصرف فرآوردههاي تخميري شير كه در آنها از پروبيوتيكهاي اسيد لاكتيك به عنوان استارتر استفاده ميشود ميتواند نقش مهمي در 484
جلد 5 شماره 1391 4 دانشگاه تهران به صورت ذخيره فريزري تهيه شد و مواد مورد استفاده براي كشت باكتري محصول شركت Roswell آمريكا بود. سلولها در محيط كشت GIBCO RPMI ) Park Memorial Institute )غني شده با 10 درصد L.گلوتامين mm (FBS )Fetal bovine serum -1 Uml 100 پني سيلين و -1 mgml 100 استرپتومايسين كشت داده شد و در انكوباتور 37 درجه سانتي گراد با 5 Co درصد به مدت چهار روز نگهداري شد. سپس فلاسك حاوي سلول پاساژ( Subculture ) داده شد. براي اين منظور از تريپسين 1X براي جداسازي سلولها از ديواره فلاسك استفاده شد و بعد از جداسازي سلولها با محيط 15000 rpm رقيق شدند.سوسپانسيون حاصل در RPMI دماي 5 درجه سانتي گراد به مدت 5 دقيقه سانتريفيوژ شد. رسوب حاصل از سانتريفيوژ در مقداري RPMI تعليق شد و تعداد سلولها با استفاده از رنگ تريپان بلو و لام ني وبار در 1 ميلي ليتر از آن شمارش گرديد. سلولهاي Caco II به ميزان 10 3 8 سلول در هر چاهك ميكروپليت كشت داده شدند و سوپرناتانت هاي به دست آمده از كشت 48 4 و 7 ساعت.L rhamnosus GG با سه تكرار در سه غلظت 00 100 و 300 ميكروليتر/ميلي ليتر به ترتيب به سلولهاي Caco II در ميكروپليت تلقيح شدند. يك رديف از ميكروپليت به عنوان شاهد مثبت در نظر گرفته شد و سلولهاي Caco II با همان ميزان ذكر شده به همراه محيط كشت RPMI تلقيح شدند و به عنوان شاهد منفي به يك رديف از ميكروپليت محيط كشت RPMI تلقيح گرديد. ميكروپليت ها به مدت 7 ساعت در انكوباتور 37 درجه سانتي گراد با 5 درصد Co نگهداري شدند. پس از اين مدت سلولهاي Caco II با كريستال ويوله رنگ آميزي وتثبيت شدند و سلولهاي مرده با شستشو حذف شدند. ميزان جذب نوري سلولهاي رنگ شده CacoII در طول موج 570 nm به وسيله دستگاه الايزاخوان (00 (Anthos اندازه گيري شد. سپس با كاهش ريسك ابتلا به سرطان كولون بازي كند( 13 ). به همين دليل گسترش انتخاب پروبيوتيكها و استفاده از آنها در مكملهاي غذايي در راستاي بهبود ارزش غذايي و سلامت انسان (به طور مثال جلوگيري از سرطان كولون) اين روزها در كانون توجه قرار گرفته است. در اين مطالعه سعي بر اين شده است كه نقش Lactobacillus rhamnosus GG (باكتري پروبيوتيك) در جلوگيري از سرطان كولون اثبات شود. مواد و و روشها باكتري و شرايط رشد:.L rhamnosus GG از آزمايشگاه پروبيوتيك و داروسازي دانشگاه تهران تهيه شد و مواد مورد استفاده براي كشت باكتري محصول شركت Merck آلمان بود. تشخيص جنس و گونه با بررسي ويژگيهاي ظاهري كلني رنگ آميزي باكتري به روش گرم تستهاي بيوشيميايي مثل تست كاتالاز وتست تخمير قند ها انجام شد. GG L. rhamnosus با غلظت 10 4 /5 Cfu/ml در 300 سي سي محيط مايع كشت MRS كشت داده شد و زا پس از گذشت هر 4 ساعت (تا 7 ساعت) فاكتور هاي حاوي محيط كشت شمارش كلي( count ( Total و ph.l rhamnosus GG به طور جداگانه اندازه گيري شد. در هر زمان نمونه برداري 50 سي سي از محيط كشت حاوي به مدت 10 دقيقه 13000 L. rhamnosus GG در rpm مايع رويي(سوپرناتانت) شد و سانتريفيوژ( Heraeus ) فيلتر 0/ ميكرومترگذرانده شد.سوپرناتانت به دست آمده از محيط كشت به دو قسمت تقسيم شد به طوري كه بود و ديگري با يكي از سوپرناتانت ها داراي ph= 4 رسانده شد. در انتها به 7= ph استفاده از NaoH 1N آنها ذخيره ازهمه كه آمد به دست شش سوپرناتانت Total Count با روش پورپليت فريزري تهيه گرديد. Human colonic ) CacoII سلول اندازه گيري شد. كشت سلول: از آزمايشگاه كشت سلول (adenocarcinoma cells 485
و) جلد 5 شماره 1391 4 استفاده از محاسبات رياضي و جذب نوري سلولهاي شاهد درصد سلولهاي زنده محاسبه شد. آناليز آماري: محاسبات آماري در تعيين اختلاف معني دار بين سه فاكتور زمان غلظت و به ph وسيله نرم افزار ANOVA انجام شد( ٠/٠٠٠١ < ارزشP ). لازم به ذكر است كه تمامي آزمايشات براي دقت در محاسبات آماري 3 بار تكرار شده است. نتايج شناسايي باكتري از نظر صحت جنس و گونه: كلني.L rhamnosus GG كرم رنگ محدب و با اندازه -5 ميلي متر مشاهده شد. در رنگ آميزي Gram به صورت باسيلهاي گرم مثبت باريك و بلند به صورت جفت يا زنجيره هاي كوتاه رؤيت شدند. حركت بود و قادر به تخمير نبود. كاتالاز منفي و فاقد ملبيوز رافينوز و گزيلوز شمارش كلي( (Total Count در محيط كشت مايع MRS.L rhamnosus GG نشان داد كه جمعيت باكتريها در هر 4 ساعت كاهش داشتند شكل (1) و جدول (1). همچنين ph محيط كشت نيز به تدريج كاهش نشان داد شكل ( جدول () GG.L rhamnosus بهترين رشد خود را در ph بين 6/5 تا 4/5 داراست و در ph زير 4 قادر به زندگي نيست. جدول 1- شمارش كلي( ( Total Count در محيطهاي كشت 0 48 4 و 7 ساعت L. rhamnosus GG در محيط آبگوشت جدول - تغييرات ph در محيطهاي كشت 0 48 4 و 7 ساعت.L rhamnosus GG در محيط آبگوشت.MRS اعداد گزارش شده زمان ميانگين سه نمونه اندازه گيري شده هستند. p H 6/5 3/8 3/6 3/4 0 4 ساعت 48 ساعت 7 ساعت تا ثير سوپرناتانت حاصل از روي رده سلول سرطاني L. rhamnosus GG : CacoII بر تلقيح سوپرناتانت حاصل از كشت 48 4 و 7 ساعت.L rhamnosus GG در محيط آبگوشت MRS با دو 4 ph و 7 در سه غلظت و 00 100 300 ميكروليتر /ميلي ليتر بر روي سلولهاي سرطاني CacoII سبب مهار رشد اين سلول سرطاني شد شكل( 3 ) و جدول( 3 )..L هدف از اين مطالعه تا ثير متابوليت هاي حاصل از بر رده سلولهاي سرطاني CacoII بود rhamnosus GG كه پس از تا ثير دادن سوپرناتانت هاي به دست آمده از اين.L rhamnosus GG كشتهاي 48 4 و 7 ساعت نتيجه آشكار شد كه اين متابوليت ها قادر به مهار رشد µl/ml سلولهاي سرطاني بودند. در اين مطالعه غلظت سوپرناتانت نرمال حاصل از كشت.L rhamnosus 100 در 4 ساعت 56 درصد در كشت 48 ساعت 61 GG رشد سلولهاي درصد و در كشت 7 ساعت 63 درصد سرطاني CacoII را مهار كردند. با توجه به نتايج آزمايشات مي توان نتيجه گرفت كه زمان مي تواند يك فاكتور موثر باشد و با توجه به آناليز آماري (جدول- 4 ) داراي افزايش معني دار بود. (p <0/0001) و به اين معناست كه با گذشت زمان و افزايش متابوليت ها اثر مهاري بر روي رشد سلولهاي سرطاني CacoII افزايش پيدا كرد. با وجود كم شدن باكتريها پس از 4 ساعت( 10 1/84) 9 ورسيدن آنها به مقدار 10 /5 8 و 10 1/9 8 به ترتيب در 48 و 7 ساعت اثر مهاري آنها بر رشد سلولهاي سرطاني CacoII.MRS اعداد گزارش شده ميانگين سه نمونه اندازه گيري شده هستند. Total count زمان /5 10 4 1/84 10 9 /5 10 8 1/9 10 8 0 4 ساعت 48 ساعت 7 ساعت 486
جلد 5 شماره 1391 4 كمتر نشد بلكه افزايش پيدا كرد به طوري كه سوپرناتانت حاصل از كشت 4 ساعت.L rhamnosus GG توانست به طور ميانگين 60/8 درصد سوپرناتانت حاصل از كشت 48 ساعت با ميانگين 71/5 درصد و سوپرناتانت حاصل از كشت 7 ساعت با ميانگين 8/1 درصد رشد سلولهاي سرطاني CacoII را مهار كند. احتمالا اين موضوع بر اين امر دلالت دارد كه چون.L rhamnosus GG در ساعت 4 در فاز سكون قرار داشته علاوه بر متابوليت هاي توليد شده در فاز لگاريتمي يك سري مواد داخل سلولي نيز در محيط رها شده كه اثر مهاري را بالا برده است(سوپرناتانت 4 ساعت در غلظت 100 µl/ml با اثر مهاري 56 درصد) ولي به مرور كه فاز سكون به اتمام مي رسد و وارد فاز مرگ مي شود اين تا ثير بيشتر مي شود (سوپرناتانت هاي 48 و 7 ساعت با اثر مهاري 61 و 63 درصد)كه شايد دليل اين امر اين باشد كه علاوه بر متابوليت هاي توليد شده در ساعتهاي پيشين به دليل از بين رفتن باكتريها يك سري مواد داخل سلولي در اثر مرگ باكتريها به سوپرناتانت اضافه شده كه سبب افزايش اثر مهاري بر روي سلولهاي سرطاني CacoII شده است. موضوع بعدي در مورد استفاده از سوپرناتانت ها با دو ph متفاوت است. سلولها به طور طبيعي با پايين آمدن ph و اسيدي شدن محيط دچار مرگ مي شوند. شكل 1- شمارش كلي( Total Count )در محيطهاي كشت 0 48 4 و 7 ساعت گزارش شده ميانگين سه نمونه اندازه گيري شده هستند..L rhamnosus GG در محيط آبگوشت.MRS اعداد شكل - - تغييرات ph در محيطهاي كشت 0 48 4 و 7 ساعت.L rhamnosus GG در محيط آبگوشت.MRS اعداد گزارش شده ميانگين سه نمونه اندازه گيري شده هستند. 487
جلد 5 شماره 1391 4 دليل به كار بردن سوپرناتانت خنثي اين بود كه مشخص شود علت مرگ سلولهاي CacoII حالت اسيدي سوپرناتانت نبوده است بلكه به دليل تركيبات موجود در سوپرناتانت بوده است. به طوري كه در غلظت µl/ml 100 سوپرناتانت حاصل از كشت 4 ساعت.L rhamnosus GG با ph نرمال و خنثي به ترتيب تا ثيري برابر 56 درصد و 59 درصد در مهار رشد سلولهاي سرطاني CacoII داشتند و همين نتايج در مورد سوپرناتانت هاي حاصل از كشت 48 و 7 ساعت.L rhamnosus GG با دو ph نرمال و خنثي تكرار شد. سوپرناتانت 48 و 7 ساعت نرمال در غلظت 10 µl/ml به ترتيب داراي اثر مهاري 61 درصد و 63 درصد بودند و سوپرناتانت 48 ساعت با ph خنثي در همان غلظت 6 درصد و سوپرناتانت 7 ساعت با ph خنثي 64 درصد رشد سلولهاي سرطاني CacoII را مهار كردند. از مقايسه تفاوتهاي عددي ذكر شده اين موضوع روشن شد كه در شرايط خنثي سوپرناتانت.L rhamnosus GG توانايي بيشتري در مهار رشد سلولها داشته است و در آناليز آماري(جدول- 4 ) تفاوت معني داري بين اعداد حاصل از مهار رشد سلولهاي CacoII به وسيله سوپرناتانت نرمال و خنثي وجود داشت( 0/0001 > p) واين موضوع اشاره دارد بر اينكه احتمالا شرايط اسيدي مانع از عملكرد يك سري از متابوليت ها شده است به طوريكه اين متابوليت ها در شرايط خنثي و با حذف شرايط اسيدي توانستند مهاري خود را اعمال كنند. متفاوت سوپرناتانت سرطاني تا ثير مورد سوم تا ثير غلظتهاي.L rhamnosus GG بر روي سلول CacoII است. به طوري كه غلظت در آناليز آماري (جدول- 4 ) داراي افزايش معني دار (0/0001> p) بود به اين معنا كه هرچه غلظت سوپرناتانت افزايش پيدا كرد به تا ثير آن نيز افزوده شد. با افزايش غلظت سوپرناتانت از 100 به 300 µl/ml اثر مهاري آن بر روي سلول سرطاني CacoII افزايش پيدا كرد.به طوري كه در غلظت 100 µl/ml به طور ميانگين اثر مهاري. 60/8 درصد در غلظت 00 µl/ml به طور ميانگين اثر مهاري 71/5 درصد و در غلظت 300 µl/ml به طور ميانگين اثر مهاري 8/1 درصد بود. اين اعداد نشان مي دهد كه اثر مهاري سوپرناتانت.L rhamnosus GG وابسته به د ز بوده و با افزايش غلظت اثر مهاري آن نيز زياد شده است. از اين بحث مي توان اين نتيجه را استنباط كرد كه در اين مطالعه سه متغير زمان غلظت و ph بر روي تا ثير سوپرناتانت.L CacoII در مهار رشد سلول سرطاني rhamnosus GG مو ثر بودند. جدول 3- تا ثير سوپرناتانت حاصل از.L rhamnosus GG در غلظتهاي 00 100 و 300 ميكروليتر/ميلي ليتر بر روي رده سلول سرطاني CacoII درصد مهار سلولهاي CacoII و ph برابر 4 100 غلظتµl/mL و ph برابر 4 00 غلظتµl/mL و ph برابر 4 300 غلظتµl/mL و ph برابر 7 100 غلظتµl/mL و ph برابر 7 00 غلظتµl/mL و ph برابر 7 300 غلظتµl/mL با ph نرمال و خنثي. زمان 4 ساعت 7 ساعت %63 %74 %85 %64 %75 %86 48 ساعت %61 %7 %83 %6 %73 %84 %56 %67 %77 %59 %68 %78 488
جلد 5 شماره 1391 4 شكل - 3 درصد مهار سلول سرطاني CacoII تحت سلول در هر چاهك با سوپرناتانت حاصل از كشت 48 4 در دو حالت خنثي و نرمال تيمار شدند تا ثير سوپرناتانت حاصل از و براي مدت 7 ساعت در. سلولها ي CacoII با مقدار 10 8 3 rhamnosus GG.L و 7 ساعت rhamnosus GG.L 37 درجه سانتي گراد به همراه در غلظتهاي 00 100 و 300 ميكروليتر/ميلي ليتر 5 درصد به وسيله دستگاه الايزا خوان در 570nm اندازه گيري شد. اعداد گزارش شده ميانگين سه نمونه اندازه گيري شده هستند. CO انكوبه شدند.ميزان جذب نوري مدل 17 جدول 4- محاسبات آماري در تعيين اختلاف معني دار بين سه فاكتور زمان غلظت و ph بوسيله نرم افزار ANOVA- (0/0001< ارزشP ( مجموع مربعات درجه آزادي( df ) ميانگين مربعات ارزش F ارزش P منبع A.غلظت >0/0001 >0/0001 >0/0001 69/85 4753/50 18/38 79/93 11/67 8/17 1 4758/83 45/33 8/17 ph.b C.زمان >0/0001 0/367 0/7 0/367 0/7 58/00 1/50 1/50 1/50 1/50 58/67 0/67 0/67 0/67 0/67 4 4 517/33 1/33 /67 1/33 /67 AB AC BC ABC خطاي خالص مجموع 0/44 36 53 16/00 4774/83 Propionibacterium acidipropionici قادر به ايجاد آپوپتوز در سلولهاي سرطاني كولون است( 7 ). در سال 009 در طي مطالعات Elise.L Ma ثابت شد كه متابوليت هاي حاصل از باكتري پروبيوتيكي Bacillus polyfermenticus قادر به مهار رشد سلولهاي سرطاني Human colon adenocarcinoma grade II cell ) HT-9 بحث تا ثير متابوليت هاي حاصل از باكتريهاي پروبيوتيك در مهار رشد سلولهاي سرطاني ثابت شده است. بوتيرات توليد شده توسط MDT-1 Butyrivibrio fibriosolvens قادر به مهار رشد تومور در حيوانات بود( 11 ). همچنين پروپيونات و استات توليد شده توسط 489
جلد 5 شماره 1391 4 Bifidobacteriunm bifidum BGN4 جدا شده از مدفوع انسان توانايي مهار رشد چندين رده سلول سرطاني را دارد. او موفق شد يك نوع پلي ساكاريد از B.bifidum به نام BB-pol استخراج كند كه توانايي مهار رشد رده سلول سرطاني كولون را در in vitro داشت (16) و اخيرا L. ثابت كرد كه عصاره سيتوپلاسمي Antonella rhamnosus GG سبب مهار رشد وتكثير دو رده سلول (line و Caco- هستند. او گزارش كرد مكانيسم دخيل در اين امر كاهش بيان پروتي ينهاي ErbB وErbB3 receptor) (Epidermal growth factor و همچنين كاهش ميزان mrna كد كننده اين پروتي ينها ست (10). فعاليت ضد توموري مواد موجود در ليزات Lactobacillus bulgaricus در سال 1995 كشف شد و Bogdanov در سال 1997 فعاليت ضد توموري بلاستوليزين (گليكوپپتيد ديواره سلولي ( L.bulgaricus عليه سلولهاي سرطاني SarcomaS180,Leukemia P-388, Plasmacytoma MOPC-315, Melanosarcoma B-16, Carcinoma LLC نشان داد (3). Ji-Uk Kim در سال 006 گزارش كرد اگزوپلي ساكاريد حاصل از rhamnosus ATCC 9595 L. در فاز لگاريتمي به صورت متصل به سلول 61 درصد و به صورت آزاد 39 درصد و اگزوپلي ساكاريد متصل به سلول در فاز سكون 3 درصد و به صورت آزاد در محيط 77 درصد وجود دارد. او ادعا كرد هر دو نوع اگزوپلي ساكاريد باعث مهار رشد سلولهاي سرطاني PANC-1 Human pancreatic carcinoma epithelial-like cell ) (Human colon adenocarcinoma grade ) و HT-9 (line II cell line در طي 7 ساعت در in vitro شدند( 8 ). به طور جالب اين دو نوع اگزوپلي ساكاريد بر روي سلولهاي سالم تا ثيري نداشتند و همچنين تا ثير اگزوپلي ساكاريد آزاد در مهار رشد دو رده سلول سرطاني بيشتر از اگزوپلي ساكاريد متصل به سلول بود. او متوجه شد كه تيمار سلولهاي سرطاني به وسيله اگزوپلي ساكاريد سبب توليد Caspase-3 در آنها در مقايسه با سلول كنترل بيشتر شده است. در نهايت پيشنهاد كرد كه مهار رشد سلولهاي سرطاني در نتيجه آپوپتوز بوده است (8). همين طور در سال 004 گزارش شد كه سلول كامل يا عصاره سلولي سرطاني HGC-7 (سلول سرطاني معده ( DLD-1 و (سلول سرطاني كولون) شده است (1). در ارتباط با متابوليت هاي استخراج شده از پروبيوتيك ها Do Kyung Lee شده از رده 008 در سال گزارش كرد كه بوتانول استخراج Bifidobacterium adolescentis توانايي مهار رشد سلولهاي سرطاني كولون HT-9, Caco-II) و (SW480 را به ترتيب 70 30 و 40 درصد را در غلظت 00µl/mL داراست و اين اثر وابسته به د ز است (9). در مطالعه اي ديگر سلول تمايز نيافته HT-9 در حضور هر يك از باكتريهاي helveticus, Bifidobacterium, L. Streptococcus و يا مخلوط Lactobacillus acidophilus. thermophilus و نتيجه به اين صورت بود كه bulgaricus.l كشت داده شد و L.acidophilus نه در تمايز سلول ونه در مهار رشد سلول HT-9 دخالت نداشت. سه باكتر ي ديگر سبب مهار رشد HT-9 شدند. بيشترين تا ثير را در مهار رشد HT-9 L.helveticus و Bifidobacterium دي پپتيديل ترانسفراز IV (HT-9 سلول داشتند.و به طور همزمان سبب افزايش (ماركر مهم و مو ثر در تمايز و آنزيمهاي حاشيه بررسي (ساكارز آمينوپپتيداز و آلكالين فسفاتاز ( شدند.كه اين امر پيشنهاد مي كند سلولها وارد فاز تمايز شده اند (). 1. Antonella O, Messa C,Linsalata M,Cavallini A,Russo F(009) Effects of Lactobacillus rhamnosus GG on proliferation and polyamine metabolism in HGC-7 human gastric and DLD- 1 colonic cancer cell lines. Immunopharmacol. Immunotoxicol. J.31: 108-116. منابع.Baricault L, Denariaz G, Houri JJ, Bouley C, Sapin C & Trugnan G(1995)Use of HT-9, a cultured human colon cancer cell line, to study the effect of fermented milks on colon cancer cell growth and differentiation. Carcinogenesis.16:45 5. 490
جلد 5 شماره 1391 4 3.Bogdanov I.G, Velichkov V.T, Gurevich A.I, Dalev P.G( 1997)Antitumor action of glycopeptides from the cell wall of Lactobacillus bulgaricus. Bull Exp Biol Med.84:1750-1753. 4.Commane D,Hughes R,Shorrt C,Rowland I( 005)The potential mechanism involved in the anti-carcinogenic action of probiotics. mutat Res.591:76-89. 5.Ewaschunk JB,Walker JW,Diaz H,Madsen KL(006)Bioproduction of conjugated linoleic acid by probiotic bacteria occurs in vitro and in vivo in mice. J Nutrition.136:1483-1487. 6.Gursoy O and Kinik O( 006)Probiotics:a new popular Option for cancer inhibition. Int. J.Dairy Sci.1:100-103. 7.Jan G,Belzacq AS, Haouzi D, Rouault A, Metivier D, Kroemer G, Brenner C(00)Propionibacteria induce apoptosis of colorectal carcinoma cells via short-chain fatty acids acting on mitochondria. Cell Death Differ.9:179-88. 8.Ji-Uk K,Younghoon K,Kyoung-Sik H,Se-Jong O, Kwang-Youn W, Jai-Neung K (006)Function of cell-bound and released exopolysaccharide produced by Lactobacillus rhamnosus ATCC 9595. J Microbiol.Biotechnol.16: 939-945. 9.Lee do K, Jang S, Kim MJ, Kim JH, Chung MJ, Kim KJ, Ha NJ (008)Anti-proliferative effects of Bifidobacterium adolescentis SPM01 extract on human colon cancer cell line. BMC Cancer. 8:310. 10.Ma EL, Choi YJ, Choi J, Pothoulakis C, Rhee SH, Im E. ( 009) The anticancer effect of probiotic Bacillus polyfermenticus on human colon cancer cells is mediated through ErbB and ErbB3 inhibition. Int. J.Cancer.5: 487-490. 11.Ohkawara S, Furuya H, Nagashima K, Asanuma N, Hino T( 005) Oral administration of Butyrivibrio fibrisolvens, a butyrate-producing bacterium, decreases the formation of aberrant crypt foci in the colon and rectum of mice. J Nutr. 135: 878-83 1.Rafter Joseph(003)probiotics and colon cancer. Best Pract Res Clin Gastroenterol.17:849-859. 13.Saikali J,Picard C,Feritas M,Holt P(004)fermented milks,probiotic cultures,and colon cancer. Nutr Cancer. 49:14_4. 14.Salminen S, Bouley C, Boutron-Ruault MC, Cummings JH, Franck A, Gibson GR, Isolauri E, Moreau MC, Roberfroid M, Rowland I(1998) Functional food Science and gastrointestinal physiology and function. Br. J. Nutr. 80:147-171. 15.Travaglione S,Fabbri A,Fiorentini C(008)The Rho-activating CNF1 toxin from pathogenic Escherichia coli :A risk factor for human colon cancer development? Infect Agent Cancer. 3:4. 16.You H.J,Oh DK and Ji GE ( 004)Anticarcinogenic effect of a novel chiroinositol-containing polysaccharide from bifidobacterium bifidum BGN4. FEMS microbial Lett.40:131-136. 491
جلد 5 شماره 1391 4 Effect of metabolites produced by Lactobacillus rhamnosus GG (probiotic bacteria) on the growth of human colon cancer cell line CacoII Parsaseresht L. 1, Fazeli M., Samadi N., Jamalifar H., Eidi A. 3 and Mahmudiaslzadeh H. 1 1. Microbiology Dept., School of Science, Science and Research Branch, Islamic Azad University, Tehran, I.R. of IRAN. Biopharmaceutical Control Dept., School of Pharmacology, Tehran University, Tehran, I.R. of IRAN 3. Biology Dept.,, Science and Research Branch, Islamic Azad University, Tehran, I.R. of IRAN Abstract In this study the inhibitory effect of metabolites produced by Lactobacillus rhamnosus GG (probiotic bacteria) on the growth of human colon cancer cell line CacoII was examined. After accuracy examination of bacterial genus and species MRS(DE Man,Rogosa & Sharpe) broth culture from L. rhamnosus GG was prepared and two supernatant from MRS broth culture which was incubated for 4,48 and 7 hours were provided.one of these supernatant with normal ph(ph=4) and the other one with using NaoH 1N was reached to ph 7.CacoII cells were seeded on 96-well microplates at 8 10 3 cells/well and obtained supernatants at concentrations of 100,00 and 300 µl/ml were inoculated to CacoII cell culture. In average,the metabolites of L. rhamnosus GG at concentrations of 100, 00 and 300 µl/ml inhibited the growth of CacoII cells by 60.8%,71.5% and 8.1% respectively. Keywords: Lactobacillus rhamnosus GG, CacoII, probiotic 49